دستگاه، غلظت را مستقیم اندازه نمی‌گیرد؛ یک سیگنال می‌خواند، مثلاً جذب نوری (OD) یا شدت نور. منحنی استاندارد رابطه‌ی سیگنال و غلظت را از روی نمونه‌هایی با غلظت معلوم (استانداردها یا کالیبراتورها) به دست می‌آورد. بعد با همین رابطه، سیگنال نمونه‌ی بیمار به غلظت تبدیل می‌شود.
کدام مدل را انتخاب کنیم؟
- لجستیک ۴ پارامتری (4PL): برای الایزا و بیشتر ایمونواسی‌ها که منحنی S شکل دارند. انتخاب پیش‌فرض است.
- خطی: برای روش‌هایی که در محدوده‌ی کار خطی‌اند، مثل بسیاری از روش‌های فتومتری بیوشیمی.
- درجه دوم: وقتی منحنی کمی خمیده است و مدل خطی خوب برازش نمی‌کند.
- لگاریتمی (log-log): وقتی غلظت‌ها چند مرتبه‌ی بزرگی با هم فاصله دارند.
اگر بروشور کیت مدل خاصی را توصیه کرده، همان را انتخاب کنید.
پارامترهای مدل 4PL به زبان ساده
- a: سیگنال در غلظت صفر (کف منحنی)
- d: سیگنال در غلظت‌های خیلی زیاد (سقف منحنی)
- c: غلظتی که سیگنال در آن به وسط فاصله‌ی a و d می‌رسد (نقطه‌ی عطف)
- b: شیب منحنی در اطراف نقطه‌ی عطف
قدم‌به‌قدم با ابزار نامدار
- صفحه‌ی منحنی استاندارد و غلظت مجهول را باز کنید.
- استانداردها: در جدول، برای هر استاندارد یک ردیف بنویسید: غلظت در ستون اول و سیگنال در ستون دوم. اگر هر استاندارد را دو بار خوانده‌اید، هر تکرار را در یک ردیف جدا بنویسید؛ میانگین نگیرید. می‌توانید دو ستون را از اکسل کپی کنید و در اولین خانه بچسبانید.
- مدل منحنی را انتخاب کنید.
- نمونه‌های مجهول: سیگنال هر نمونه را وارد کنید. نام نمونه اختیاری است.
- اگر نمونه را رقیق کرده‌اید، ضریب رقت را وارد کنید تا غلظت نهایی هم حساب شود.
اگر بروشور کیت کم کردن سیگنال بلانک را خواسته، این کار را پیش از وارد کردن اعداد انجام دهید.
یک مثال
با دکمه‌ی «داده‌ی نمونه»، هفت استاندارد از ۰ تا ۲۰۰ و چهار نمونه‌ی مجهول بارگذاری می‌شود. با مدل 4PL، ضریب تعیین (R²) برابر ۰٫۹۹۹۹۸ است و بازیابی همه‌ی استانداردها بین ۹۸ تا ۱۰۴ درصد است. غلظت سه نمونه‌ی اول در محدوده است (حدود ۱۹٫۶، ۶۳٫۹ و ۱۳۹٫۳). سیگنال نمونه‌ی چهارم از بالاترین استاندارد بیشتر است و ابزار پیام «رقیق کنید» می‌دهد.
کیفیت منحنی را چطور بسنجیم؟
- بازیابی استانداردها (Back-calculation): مهم‌ترین شاخص است. ابزار هر استاندارد را مثل یک نمونه‌ی مجهول دوباره حساب می‌کند. بازیابی ۸۰ تا ۱۲۰ درصد معمولاً قابل قبول است و برای پایین‌ترین استاندارد گاهی ۷۵ تا ۱۲۵ درصد.
- R²: باید نزدیک ۱ باشد، ولی به‌تنهایی کافی نیست؛ یک منحنی می‌تواند R² بالا داشته باشد و در غلظت‌های پایین خطای زیادی بدهد.
- نمودار: نگاه کنید نقطه‌ای از منحنی فاصله‌ی غیرعادی نداشته باشد.
خطاهای رایج
- گزارش غلظت بیرون از محدوده‌ی استانداردها. منحنی فقط بین پایین‌ترین و بالاترین استاندارد معتبر است. نمونه‌ی بالاتر را رقیق و دوباره آزمایش کنید و نمونه‌ی پایین‌تر را «کمتر از …» گزارش کنید.
- استفاده از مدل خطی برای الایزا. این کار در دو انتهای منحنی خطای بزرگی ایجاد می‌کند.
- میانگین گرفتن از تکرارها پیش از ورود. با وارد کردن جداگانه‌ی تکرارها، پراکندگی آن‌ها هم در برازش منعکس می‌شود.
- استفاده از منحنی یک سری کیت برای سری دیگر. برای هر سری کار یا هر لات کیت، منحنی تازه لازم است.
این مطلب برای آزمایشگاهیان، پزشکان و دانشجویان نوشته شده است. تفسیر نهایی واریانت‌ها و تصمیم بالینی با متخصص ژنتیک و پزشک معالج است.